活性炭分離蛋白質(zhì),根據(jù)活性炭的大小和有效電荷的不同，應(yīng)用活性炭來分離蛋白質(zhì)。為了有效地分離蛋白質(zhì)與活性炭，建議了三條準(zhǔn)則。(1)活性炭可用于從較大的蛋白質(zhì)中有效去除較小的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。(2)在接近雜質(zhì)等電點(diǎn)的溶液pH下，最有效地去除較小的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，其中它們具有最小的有效電荷。(3)最有效的從活性炭回收小蛋白質(zhì)的過程發(fā)生在離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)更遠(yuǎn)的溶液pH，在那里強(qiáng)電荷。測量各個聚合物和蛋白質(zhì)的結(jié)合能力的研究被用于開發(fā)這三個指導(dǎo)方針，然后將它們應(yīng)用于幾種不同蛋白質(zhì)混合物的分離。活性炭分離蛋白質(zhì)的能力被證明是廣泛適用于三種不同類型的活性炭通過靜態(tài)處理和流過活性炭填充柱。

　　活性炭是一種具有高表面積的多孔材料，通過非共價相互作用物理吸附分子。常用于水凈化和食品飲料行業(yè)，用于非選擇性去除較低濃度的蛋白質(zhì)。另外，活性炭用于從蛋白質(zhì)溶液中去除小分子，并且通常使用葡聚糖涂層來防止蛋白質(zhì)與活性炭表面之間的接觸。然而，盡管涉及蛋白質(zhì)的活性炭有很多應(yīng)用，但是對影響這些相互作用的因素的理解有限。

　　我們最近發(fā)現(xiàn)某些等級的活性炭可用于選擇性地從含有單克隆抗體的進(jìn)料流中去除宿主細(xì)胞蛋白(HCP)雜質(zhì)。我們感興趣的是，這種相對便宜的吸附材料可用于分離蛋白質(zhì)，并深入研究了解為什么活性炭選擇性地吸附HCP而不是單克隆抗體。因此，我們研究了不同條件下幾種模型聚合物和蛋白質(zhì)與活性炭的吸附，以確定控制其相互作用的關(guān)鍵因素。根據(jù)我們對活性炭的吸附研究，我們提出了三種有效分離蛋白質(zhì)的指導(dǎo)方針，并能夠證明其在分離幾種不同蛋白質(zhì)混合物中的應(yīng)用。

　　蛋白質(zhì)大小是影響蛋白質(zhì)與活性炭分離的第一個因素。對活性炭的早期研究證實(shí)，在含水條件下小分子的結(jié)合強(qiáng)度隨著同系列中單元數(shù)量的增加而增加。這種關(guān)系符合Traube的表面張力規(guī)律，可以很好地解釋甲酸，乙酸，丙酸，丁酸等一系列小分子吸附強(qiáng)度的增加然而，盡管大分子如聚合物和蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的結(jié)合強(qiáng)度，但其容量受限于其不能進(jìn)入中孔(2-50nm)和微孔(<50nm)內(nèi)所含活性炭表面積的顯著部分2納米)。從活性炭內(nèi)表面的部分排除大分子應(yīng)該允許它從較大的蛋白質(zhì)中選擇性地去除較小的蛋白質(zhì)，如果孔的尺寸足夠的話。蛋白質(zhì)有效電荷對其與活性炭相互作用的影響也將受到其表面上的官能團(tuán)的影響。在這項(xiàng)研究中調(diào)查的活性炭的類型來自用磷酸化學(xué)活化的木材。先前已經(jīng)報道過，這些類型的活性炭具有主要由芳族基團(tuán)和含氧官能團(tuán)組成的表面，其取決于活化過程在濃度和類型上變化。在含水條件下，蛋白質(zhì)應(yīng)該能夠通過疏水性相互作用與活性炭表面上的芳香族結(jié)構(gòu)結(jié)合，但是這種相互作用也受到表面上任何帶電基團(tuán)的影響。檢測活性炭和蛋白質(zhì)之間相互作用的一種方法是測量容量作為溶液pH的函數(shù)。例如，如果溶液的pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，那么它將具有總體正電荷，因此應(yīng)當(dāng)更容易被帶負(fù)電的表面吸收。文獻(xiàn)中有報道指出蛋白質(zhì)上的電荷確實(shí)影響活性炭的蛋白結(jié)合能力。

　　用活性炭分離低分子量蛋白質(zhì)

　　雖然活性炭的大小選擇性使其成為純化較高分子量蛋白質(zhì)的理想選擇，但是我們好奇它是否也可用于純化較低分子量的蛋白質(zhì)。如果較低分子量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物和蛋白質(zhì)雜質(zhì)具有顯著不同的等電點(diǎn)，這可能是可能的。然后可以在接近蛋白質(zhì)雜質(zhì)的等電點(diǎn)的溶液pH下進(jìn)行選擇性純化，并進(jìn)一步遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)產(chǎn)物的等電點(diǎn)。在此pH下，靜電排斥會降低活性炭對更強(qiáng)電荷蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)合能力，并最大化其對弱電荷蛋白質(zhì)雜質(zhì)的結(jié)合能力。c和1.0mg / mL的α-乳清蛋白，在靜態(tài)結(jié)合條件下用活性炭在4.0-9.0的pH下進(jìn)行。通過分析反相HPLC測定用活性炭處理后保留在溶液中的細(xì)胞色素c和α-乳清蛋白的百分比，并將其作為溶液pH的函數(shù)作圖(圖1)。

　　圖1. 在靜態(tài)結(jié)合條件下用活性炭處理1：1溶液后剩余的細(xì)胞色素c和α-乳清蛋白的百分比作為溶液pH的函數(shù)繪制。

　　現(xiàn)用活性炭處理1：1溶液后剩余的細(xì)胞色素c和α-乳白蛋白的百分比隨溶液pH而變化很大。在pH4.0和5.0時，在等電點(diǎn)4.8附近除去最大量的α-乳白蛋白。(28)相比之下，最大量的細(xì)胞色素c在pH9.0被除去，最接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)10.5。(27)在6.0或7.0的中等pH下，活性炭除去了相似量的兩種蛋白質(zhì)。

　　用活性炭流通分離蛋白質(zhì)

　　在之前的實(shí)驗(yàn)中證明，在靜態(tài)結(jié)合條件下，活性炭可用于分離蛋白質(zhì)。然而，通過流過填充的活性炭柱來處理蛋白質(zhì)溶液會更方便。流過吸附介質(zhì)是有利的，因?yàn)樗鼫p少了處理時間，并且消除了靜態(tài)處理后除去介質(zhì)所需的固/液分離步驟。在該實(shí)驗(yàn)中，將由代表蛋白質(zhì)雜質(zhì)的0.5mg / mL的細(xì)胞色素c和代表pH 4.0或9.0的產(chǎn)物的5.0mg / mL的α-乳清蛋白組成的溶液流過填充有活性炭的色譜柱。細(xì)胞色素c的濃度通過分析型反相HPLC測定柱級分中的α-乳白蛋白，并作為α-乳白蛋白的質(zhì)量加載量除以活性炭的體積的函數(shù)繪圖(圖2)。

　　圖2. 在pH4.0或pH9.0的0.5mg / mL的細(xì)胞色素c和5.0mg / mL的α-乳清蛋白溶液通過色譜柱后，收集12.5mL級分中的細(xì)胞色素c和α-乳清蛋白的濃度活性炭。

　　活性炭填充柱的流通實(shí)驗(yàn)結(jié)果與靜態(tài)結(jié)合研究結(jié)果非常吻合，這些研究顯示出對溶液pH的強(qiáng)烈依賴性。在pH 4.0時，細(xì)胞色素c雜質(zhì)在第一部分中突破。相反，在pH9.0時，直到第七部分(其中柱裝載有1.09g的α-乳白蛋白/ mL活性炭)未觀察到細(xì)胞色素c雜質(zhì)的穿透。測量的α-乳白蛋白的總體回收率在pH 4.0時僅為88%，而在pH 9.0時回收率為94%。溶液通過pH4.0的活性炭柱后，細(xì)胞色素c的濃度雜質(zhì)從100 000增加到106 125 ppm，導(dǎo)致只有-0.03 LRV。相比之下，在pH 9.0時，細(xì)胞色素c雜質(zhì)的濃度從100 000顯著降低至10 584ppm，導(dǎo)致0.98LRV。

　　已經(jīng)證明，蛋白質(zhì)的大小和有效電荷強(qiáng)烈地影響其在活性炭上的吸附。用不同分子量的葡聚糖和磺化聚苯乙烯進(jìn)行的結(jié)合研究證實(shí)活性炭對較大分子具有較低的結(jié)合能力。這表明較大的蛋白質(zhì)不能夠獲得較小孔中所包含的活性炭內(nèi)表面積的顯著百分比。當(dāng)溶液pH值接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，發(fā)現(xiàn)活性炭具有最大的結(jié)合能力，其中蛋白質(zhì)上有最小的有效電荷。這種理解被應(yīng)用于純化更高分子量的單克隆抗體，其中發(fā)現(xiàn)在最接近雜質(zhì)等電點(diǎn)的溶液pH下最有效地去除了較低分子量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。